real-time Reverse Transcription PCR

实时逆转录荧光定量PCR

实验操作

1. 目的细胞的培养

2. RNA的提取 实验24

3. cDNA的制备

   1. 反转录体系
   2. 引物设计
   3. 半定量PCR反应体系
   4. RF PCR反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM

4. 核糖核酸酶RNase H降解原始mRNA，留下附着在从DNA上的primer

5. 在DNA polymerase下合成互补链

6. PCR 靶向扩增

7. 实时荧光定量

   1. 第一种仅在与双链DNA结合时才会在每个PCR循环结束时适当波长的光下激发染料发出荧光，非特异
   2. 第二种使用与荧光团和猝灭剂分子相连的互补序列特异性寡核苷酸探针，持续暴露于适当波长的光下，并且猝灭剂分子在彼此靠近时吸收荧光团的荧光。DNA聚合酶在延伸过程中分离荧光团，防止淬灭

8. 分子表现出的荧光被光电探测器检测，将荧光信号转换为可读格式。==RFU==实时荧光定量RT-PCR需要配备检测器的专用PCR仪来实现实时定量\[Threshold\ Cycle(C_t)\]是每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的PCR循环数，远高于背景荧光 初始样品中目标RNA的量越大，荧光显著增加的速度就越快，从而导致较低的Ct.即\[C_t=\frac{1}{Target RNA}\] \[ Ct=a×log \ mRNA + b \] 绝对定量：将样品荧光与已知 DNA 浓度制备的荧光标准曲线比较

   相对定量：将样品荧光与参考荧光比较